【翻译】增强子重编程SMARCA2降解剂治疗SMARCA4突变癌的研究

原文链接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(24)00396-9
' t" a& [1 }; t- `, k# c4 |) z' S以下翻译由AI提供
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3 b2 p$ o  n' N, A% B亮点[size=0.75]•
2 V1 o8 K( O4 Z+ o5 VSMARCA2降解降低了增强子的染色质可及性

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4 T( B! |. ]  k2 H3 c" }失去可及性的增强剂富含TEAD结合基序

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SMARCA2 PROTAC和TEAD抑制剂协同抑制生长SMARCA4突变体
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! D* A) l1 S* b, X8 ~8 ~, x7 t这种组合可以用来开发新的治疗方案SMARCA4突变体
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# A4 k8 m; a% g2 i8 J摘要基因组研究已经确定了SWI/SNF (开关/蔗糖非发酵) 染色质重塑复合物亚基的频繁突变，包括SMARCA4和ARID1A在非小细胞肺癌 (NSCLC)。遗传证据表明，旁系同源物SMARCA2是合成致命的SMARCA4提示SMARCA2是一个有价值的治疗靶点。然而，SMARCA2的选择性抑制剂的发现一直是具有挑战性的。在这里，我们利用结构-活性关系 (SAR) 研究来开发YD23，一种靶向smarca2的有效且选择性的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)。从机制上讲，我们表明SMARCA2降解诱导增强子景观的重编程SMARCA4-在参与细胞增殖的基因的增强子处染色质可及性丧失的突变细胞。此外，我们确定了YAP/TEADas SMARCA2的主要合作伙伴，以推动SMARCA4-突变细胞.最后，我们证明YD23具有有效的肿瘤生长抑制活性。SMARCA4-突变异种移植物.这些发现为开发SMARCA2降解剂作为针对SMARCA4-突变肺癌.
/ e5 K; _7 b. I3 f6 q* K, W/ t# S' c图形摘要

                               
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关键词

• SMARCA2
• SMARCA4
• SWI/SNF
• PROTAC
• 肺癌
• YAP/TEAD
• 合成杀伤力
• 增强器可访问性
• 细胞周期
• 基因调控
  

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导言肺癌是一种毁灭性疾病，仍然是癌症死亡的首要原因，占所有癌症相关死亡的四分之一。1,2尽管靶向疗法和免疫疗法有所改善，但大多数肺癌患者仍然缺乏有效的治疗选择，这凸显了对新型治疗方法的迫切需求。3
2 Z2 h" N' `3 q$ i; |3 KSWI/SNF (开关/蔗糖非发酵) 染色质重塑复合物的亚基，包括SMARCA4(也称为BRG1) 和ARID1A经常发生突变，范围从早期疾病的16% 到晚期肺癌的33%。4,5,6,7,8,9,10此外，对44个基因组研究的荟萃分析表明，所有实体瘤中的20% 在SWI/SNF复合物的亚基中具有突变，使其成为癌症中最常见的突变复合物之一。9SWI/SNF复合物是一种大型多蛋白组装体，其使用来自ATP水解的能量来重塑核小体并促进主要的染色质依赖性细胞过程，例如DNA复制，修复，和转录。11,12SWI/SNF复合物中的突变是失活的，不能直接靶向治疗。因此，在SWI/SNF突变体中鉴定合成致死或其他易感性方面存在大量努力。虽然许多研究报告了增强的敏感性SMARCA4-突变肺癌抑制氧化磷酸化 (OXPHOS)，13极光激酶A，14EZH2,15ATR,16和KDM6甲基转移酶，17这些都没有进展到先进的临床研究。有趣的是，有几份报告表明，旁白SMARCA2是合成的致命遗传相互作用伙伴SMARCA4在肺癌细胞系中，这表明它可能是有吸引力的治疗靶标。18,19,20,21,22,23然而，开发smarca2的选择性和有效的小分子抑制剂一直是具有挑战性的。虽然靶向溴结构域的抑制剂不是有效的，但是靶向SMARCA2的atp酶结构域的那些是高毒性的，因为它们非选择性地靶向其他atp酶如SMARCA4，突出了对靶向SMARCA2的替代方法的需要。19,24蛋白水解靶向嵌合体 (protac) 已经成为一种创新的治疗方法，以扩大可靶向基因组的库。25最近，已经报道了几种SMARCA2降解剂具有超过SMARCA4的选择性。26,27,28然而，SMARCA2降解的作用机制尚未阐明。
在这里，我们报告了通过化学接头将SMARCA2溴结构域配体与pomalidomide (E3连接酶配体) 缀合而发现了有效且选择性的SMARCA2降解PROTAC。我们表明，该系列的原型成员YD23选择性地降解SMARCA2并抑制SMARCA4-突变肺癌细胞系。从机制上讲，我们证明了SMARCA2在SMARCA4-突变细胞诱导增强子景观的深刻重编程，在参与细胞增殖的基因的增强子处染色质可及性明显丧失。此外，我们确定了Hippo途径的核效应子YAP/TEAD是SMARCA2在推动SMARCA4-可以被SMARCA2降解破坏的突变癌细胞。重要的是，可以用另外的SMARCA2降解剂ACBI2来概括增强剂的放松调节和YAP/TEAD的协同性，这表明存在机械类别效应。此外，我们证明YD23在多个SMARCA4-突变异种移植物.总之，这些发现提供了证据表明，SMARCA2的选择性靶向导致增强剂的治疗有益的重编程，并提出了SMARCA2降解剂作为治疗剂的未来临床前和临床开发的协同组合伙伴。SMARCA4-突变肺癌.
结果YD23是SMARCA2的强效和高选择性降解剂PROTAC技术的独特和有吸引力的特征是从混杂的配体到感兴趣的蛋白质产生选择性降解剂的可能性。29由于SMARCA4和SMARCA2的溴结构域之间的高度相似性，目前不存在选择性配体。因此，我们着手产生靶向smarca2的有效和选择性protac。为此，我们采用了非选择性的2-(6-氨基哒嗪-3-基) 苯酚基配体Gen-1，该配体能够以高亲和力与SMARCA2/4溴结构域结合。30我们通过化学接头将Gen-1与泊马度胺结合，泊马度胺是一种cereblon (CRBN) E3连接酶靶向配体。在对长度和组成可变的接头进行广泛的结构活性关系 (SAR) 研究后，我们确定了一系列以YD23为代表的化合物，这些化合物能够选择性降解SMARCA2 (图1A;数据S1)。
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[size=0.875]图1 [size=0.875]SMARCA2的高选择性降解剂YD23的发现
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然后，我们对YD23对一组肺癌细胞系的生化和表型作用进行了全面评估。为了帮助解释结果并更有效地证实遗传方法的药理学发现，我们利用了Broad研究所DepMap项目的细胞系，该细胞系进行了全基因组CRISPR-Cas9依赖性筛选 (DepMap；https://depmap.org/portal/)。这些筛选已经确定了具有失活作用的细胞系的显著SMARCA2依赖性SMARCA4突变 (图S1A-S1E；表S1)。
7 l0 c( G3 Q* e& C. p最初，我们在表达SMARCA2和SMARCA4的H1792细胞中，在24至96小时内，在1 nM至10μm的剂量范围内测试了YD23 (SMARCA4-WT)。YD23表现出缓慢的降解动力学，并在72-96小时内最佳降解SMARCA2，因此我们随后的机理研究主要在96小时进行 (图S1F)。
2 x" `% ~+ m. t4 Y' r5 x, k2 jYD23在H1792细胞中以64 nM的半最大降解浓度 (DC50) 降解SMARCA2，同时实现88% 的最大降解 (Dmax) (图1B)。在H1975中观察到类似的结果SMARCA4-WT细胞，DC50为297 nM，Dmax为95% (图1B)。重要的是，YD23对SMARCA4的影响最小，高达10 μ m，直流50和D最大值在两种细胞系中均大于10 μ m。进一步扩展这些结果，我们在另外10个小组中评估了YD23SMARCA4-WT细胞系。总而言之，YD23有效地降解了SMARCA2，中值DC50为92.8纳米，实现了D最大值90%，而YD23在测试的细胞系中适度降解SMARCA4，中值DC50超过10 μ m和D最大值只有35% (图1C-1E和S1G;表S2)。为了比较，我们使用双SMARCA2/SMARCA4降解剂ACBI1作为非选择性对照，20正如预期的那样，这会有效地降低SMARCA2 (DC5011.1 nM, D最大值96%) 和SMARCA4 (DC5031.3 nM, D最大值95%) (图1B-1E和S1G;表S2)。我们还在12个小组中评估了YD23SMARCA4-根据DepMap对SMARCA2耗竭敏感的突变肺癌细胞系 (表S1)。总的来说，YD23退化的SMARCA2与中值DC5030.2 nM，并实现了D最大值94%，而ACBI1降解了SMARCA2，DC中值506.5 nM和D最大值of 96% (图1F-1H和S1H;表S2)。因此，YD23对SMARCA2具有高度选择性，降解smarca4所需的浓度增加超过100倍。
接下来，我们进行了一系列救援实验，以确认YD23是真正的PROTAC。YD23对SMARCA2的降解需要SMARCA2和CRBN的结合，因为SMARCA2的降解可以通过添加过量的游离Gen-1配体或pomalidomide来挽救 (图S2A和S2B)。我们还表明，通过增加蛋白酶体抑制剂 (硼替佐米) 的浓度来阻断SMARCA2的YD23-mediated降解，观察到的降解依赖于蛋白酶体 (图S2C)。此外，我们通过CRISPR-Cas9产生了一个CRBN敲除克隆，有效地消除了SMARCA2的YD23-mediated降解 (图S2D)。
9 I, I, A9 f; S, ], Y为了理解YD23对细胞蛋白质组的总体影响，进行了使用串联质量标签 (TMT) 质谱的无偏倚和定量蛋白质组学。该分析量化了8，081种蛋白质，其中SMARCA2是两者中最显着耗竭的蛋白质之一SMARCA4-WT和SMARCA4-突变细胞系，而SMARCA4在很大程度上不受影响SMARCA4-WT单元格 (图1我和S2E;表S3)。蛋白质组学分析显示，YD23治疗未引起其他核心SWI/SNF亚基的显着变化，包括含溴结构域蛋白PBRM1SMARCA4-WT单元格 (图1我和S2E)。然而，PBRM1水平在SMARCA4-类似于SMARCA2的突变细胞 (图1我和S2E)。通过比较，蛋白质组学分析显示ACBI1-treated细胞96小时降解SMARCA2和SMARCA4SMARCA4-WT细胞的程度相似，两种基因型的PBRM1，突出了YD23的选择性特征 (图S2F)。YD23和ACBI1处理的免疫印迹分析证实了蛋白质组学丰度数据SMARCA4-WT和SMARCA4-突变细胞 (图S2G和S2H)。一些未知与SWI/SNF复合物相关的蛋白质如RNF166和LDB3在YD23-treated细胞中也被耗尽。RNF166是泊马度胺的已知靶标，泊马度胺是我们的PROTAC中使用的E3连接酶募集部分。31重要的是，我们发现这些蛋白质的耗竭不太可能导致YD23的生长抑制表型，因为LDB3和RNF166的shRNA敲低不会影响细胞生长 (图S2I和S2J)。总之，这些数据将YD23确立为有效且选择性的SMARCA2降解PROTAC。
YD23选择性抑制生长SMARCA4-突变肺癌细胞系接下来，我们通过监测体内的克隆生长来评估YD23的生长抑制活性。SMARCA4-突变体和SMARCA4-WT肺癌细胞系。我们首先测试了YD23对H322和H1693生长的影响，两个SMARCA4-突变肺癌细胞系显示依赖于DepMap数据集中的SMARCA2 (表S1)。YD23引起H322和H1693细胞克隆生长的剂量依赖性抑制 (图2A;表S2)。重要的是，当在过量的游离CRBN结合配体 (pomalidomide) 或SMARCA2溴结构域结合配体 (Gen-1) 存在下培养时，YD23在H322和H1693细胞中的生长抑制活性被显著挽救。(图S3A和S3B)。此外，当我们在H322细胞中使用CRISPR-Cas9敲除CRBN时，我们观察到完全拯救 (CRBN-KO) (图2B)，表明YD23引起的表型效应完全基于target和PROTAC机制。在确认YD23的功能特异性后，我们描绘了一组更大的肺癌细胞系，以确定在SMARCA2降解中观察到的选择性是否转化为对克隆形成生长的选择性抑制。YD23选择性抑制生长SMARCA4-突变肺癌细胞系与SMARCA4-WT细胞 (中值IC50每组分别为0.11μm和6.0 μ m) (图2C-2E，S3C和S3D；表S2)。相比之下，ACBI1有效地抑制了两种基因型的克隆生长 (中位数IC50每组分别为0.018μm和0.11 μ m)。重要的是，这导致YD23在ACBI1中的选择性至少提高了57倍。SMARCA4-WT表达细胞。此外，两种基因型中YD23的克隆生长差异并非由于SMARCA2降解的差异 (p = 0.59, ns) (图S3E)。

                               
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[size=0.875]图2 [size=0.875]YD23在肺癌细胞系中的选择性生长抑制活性
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# z' b" Q/ ^7 i2 H. KSMARCA2降解破坏了增强子的染色质可及性，从而禁用了细胞周期转录程序接下来，我们试图确定SMARCA2的生长抑制活性的机制基础。SMARCA4-突变的癌细胞相比SMARCA4-WT细胞。SWI/SNF复合物与其他表观遗传调节因子和转录因子一起建立控制基因调控网络的染色质景观。32由于含有SWI/SNF ATPase的复合物会主动重塑核小体DNA，因此我们在成对的SMARCA4-WT和SMARCA4-突变细胞系，使用转座酶可接近的染色质的测定，然后测序 (atac-seq)。我们选择H322细胞作为代表SMARCA4-对YD23-mediated生长抑制敏感的突变细胞系和H1975作为SMARCA4-WT细胞系对YD23-mediated对细胞生长的影响不敏感 (图2A-2D，S3C和S3D；表S2)。超过30，000个位点的全球变化显示，在H322细胞中YD23处理96小时后，染色质可及性总体降低，占所有分析位点的33.1% (图3A和3B)。相反，在H1975细胞中，整体染色质可及性几乎没有变化，因为在YD23处理后，所有位点中只有5.1% 的染色质可及性降低 (图3A和3B)。染色质可及性最明显的变化发生在H322细胞的远端基因间区域和内含子，而染色质可及性在H1975细胞的这些位点没有显着变化 (图3B)。相比之下，ACBI1在内含子和远端基因间位点的染色质可及性均显着但非选择性降低。SMARCA4-WT (1975年为43.6%) 和SMARCA4-突变体 (H322中为43.4%) 细胞系 (图3A和3B)。YD23和ACBI1在远端基因间和内含子处的这些变化与位于增强子以调节基因表达的SWI/SNF复合物一致。33,34,35因此，我们接下来通过将与YD23或ACBI1处理相关的atac-seq峰变化注释为H3K27ac染色质免疫沉淀测序 (chip-seq)，在推定的增强子处询问染色质可及性每个相应细胞系的峰值信号概况。在H322细胞中被注释为增强子的所有atac-seq峰中，约有20% 被YD23 (丢失增强子) 丢失，峰强度相应降低了3.57倍 (图3C和3D)，而被鉴定为YD23和DMSO共有的增强剂 (79%，常见增强剂) 或YD23特异性的增强剂 (1.4%，增益增强剂) 的峰强度几乎没有变化 (图3C, 3D,S4A和S4B)。重要的是，在H1975细胞中被鉴定为丢失增强剂的增强子仅占所有峰的8%，峰强度的变化明显较小 (1.18倍) (图3A和3B)，并且在确定为常见 (88%，常见增强剂) 或对YD23 (4%，增益增强剂) 特异性的增强剂中观察到的峰强度几乎没有变化 (图S4A和S4B)。与全局atac-seq分析类似，这也转化为位于H322细胞远端基因间区域和内含子内的增强子的染色质可及性降低，但在H1975细胞中则没有 (图3C)，表明YD23对增强子重编程几乎没有影响SMARCA4-WT细胞。ACBI1处理显着降低了两种细胞系中染色质损失增强子的可及性; H1975中的43% 和H322细胞中的29%，峰值强度分别降低了3.97倍和6.30倍 (图3C和3D)。染色质可及性和基因组基因座改变的这些变化在全局和活性增强子处类似地在另外的配对组中再现SMARCA4-WT (HCC44) 和SMARCA4-用YD23或ACBI1处理后的突变 (H1693) 细胞系 (图S4C-S4H)。为了证明染色质可及性不是由于YD23的潜在脱靶效应，我们比较了H322和H1693中ACBI1或YD23处理后丢失增强剂的重叠SMARCA4-突变细胞系 (图S5A)。虽然ACBI1的丢失增强子位点的总体数量较大，但在两种细胞系中几乎所有YD23位点都与ACBI1重叠，表明YD23具有显着的靶向作用。接下来，我们通过比较H1693细胞中ACBI1或YD23的丢失增强子位点与SMARCA2基因敲除的重叠，进一步验证了靶向选择性 (图S5B和S5C)。在ACBI1处理丢失的所有增强子位点中，大约70% 与SMARCA2敲除重叠 (图S5B)。相比之下，由于YD23处理而导致的增强子位点丢失的大约90% 与SMARCA2敲除重叠，表明高度的靶向活性 (图S5C)。为了证实这些发现，我们接下来试图通过使用另一种选择性SMARCA2降解剂acbi2来确定增强子谱。26我们证明了H322细胞中ACBI2增强子的染色质可及性降低的高度相似的表型，增强子的高度重叠与ACBI2和YD23之间的可及性丧失，强烈表明该表型是由于SMARCA2降解引起的一类效应 (图S5D-S5H)。
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[size=0.875]图3 [size=0.875]YD23重新编程增强子染色质可及性SMARCA4-突变细胞
) G5 P/ z6 N$ t1 _[size=1.125][size=0.875]显示完整标题[size=0.625][size=0.875em]图查看器
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- B; T4 S/ a( z8 L( F; K: ^, w1 s由于增强子在转录调控中起着至关重要的作用36,37并且SWI/SNF复合物经常占据增强子，我们使用RNA测序 (rna-seq) 进行了全局转录组分析。基因集富集分析 (GSEA)38揭示了top途径在SMARCA4-用YD23处理的突变细胞富集了E2F靶标，G2/M和有丝分裂纺锤体基因集 (图4A和4B)。我们使用通过rt-qpcr从H322细胞中的每个基因集中鉴定的几个顶级细胞周期基因验证了这些表达变化的下调，这种作用在H1975细胞中未观察到 (图4C和S6A)。接下来，我们通过鉴定两个H1975中所有增强子的相邻连锁基因，对atac-seq和rna-seq数据集进行了整合分析。SMARCA4-WT和H322SMARCA4-突变细胞系，并根据增强子是否丢失，获得或根据atac-seq峰强度将这些基因分为3组 (图4D和4E)。总的来说，我们的分析观察到，在H322细胞中，YD23治疗后，与丢失增强子相关的下调基因和与普通或增益增强子相关的上调基因之间呈正相关。而在H1975细胞中没有发现增强子和基因表达变化之间的相关性 (图4D和4E)。在H1693细胞中也有类似的正相关，但在HCC44细胞中则没有 (图S6B和S6C)。为了进一步探索YD23处理对增强子处染色质可及性和靶基因表达的影响，我们通过CUT & RUN评估了H322细胞中的SMARCA2结合 (图S6D和S6E)。如预期的，YD23对SMARCA2的降解在很大程度上消除了SMARCA2在增强子处的结合。重要的是，SMARCA2结合的丧失与这些位点的染色质可及性降低相关 (图S6D) 和基因表达减少的趋势 (图S6E)。
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7 B, }9 }9 W+ E                               
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[size=0.875]图4 [size=0.875]YD23调节增强子的细胞周期转录程序SMARCA4-突变细胞
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3 O- ?! F( X+ o. u. c我们接下来注释了与H1975和HCC44共有的丢失增强子相关的基因SMARCA4-WT细胞系和H322和H1693SMARCA4-突变细胞系 (图S6F)。这项分析确定了255个常见基因 (占总数的7.2%) 与SMARCA4-WT细胞和238个常见基因 (占总数的9.4%) 与SMARCA4-突变细胞.值得注意的是，GSEA对这些带注释的基因在丢失增强子处的分析显示，有丝分裂纺锤体是两个基因中最高的富集基因集。SMARCA4-WT和SMARCA4-突变细胞 (图S6G)。然而，与丢失增强子相关的基因在SMARCA4-WT细胞，包括那些参与有丝分裂纺锤体形成的细胞，没有被YD23显著下调 (图S6H)。另一方面，SMARCA4-突变细胞表现出几个显着下调的基因，包括ARHGAP29和NEDD9 (图S6H)，两个基因参与有丝分裂纺锤体的维持和增殖。39,40 NEDD9和ARHGAP29基因组基因座显示与这些基因相邻的几个推定的调节增强子元件，在YD23处理后，这些基因的染色质可及性明显丧失。SMARCA4-突变细胞，但不在SMARCA4-WT单元格 (图4F, 4G,S6I和S6J)。但是，ACBI1在这些基因位点没有选择性，因为两种基因型的染色质可及性均相似。总之，这些结果强烈表明SMARCA2降解介导增强子重编程SMARCA4-突变细胞并下调参与细胞周期调节的关键基因的表达，以选择性地抑制细胞增殖。
SMARCA2和YAP/TEAD在增强剂上合作促进细胞生长SMARCA4-突变肺癌细胞系接下来，我们试图破译由于SMARCA2降解导致的增强子重编程和相关生长抑制活性的分子机制。De novo丢失的增强子的基序分析SMARCA4-WT和SMARCA4-用YD23处理的突变细胞系显示富集的顶部基序属于AP-1转录因子家族 (图5A和5B)。这与最近的发现一致，即鉴定出AP-1转录因子作为先驱因子并帮助将SWI/SNF复合物靶向基因组基因座。41,42更重要的是，SMARCA4-与缺失的增强子相比，缺失增强子的突变细胞系富集了TEAD基序SMARCA4-WT单元格 (图5A和5B)。众所周知，TEADs (TEAD1-4) 通过与YAP及其旁系同源物TAZ结合而被认为是Hippo途径的最终核效应物，因为YAP/TAZ不能直接结合DNA。43因此，大多数 (即，高达90% 以上) YAP/TAZ结合发生在TEADs中，并且与启动子相反，在远端增强子处发挥转录控制。44,45,46,47接下来，我们试图使用正交方法来识别其他确证数据，以加强我们对YAP/TEAD和smarca2之间潜在相互作用的初步观察。为此，我们检查了DepMap CRISPR-Cas9全基因组依赖性数据集，并询问细胞对SMARCA2和YAP/TEAD的依赖性之间是否存在任何相关性。令人惊讶的是，几种具有失活作用的细胞系SMARCA4突变表现出SMARCA2和YAP/TAZ耗竭之间的共同依赖性，这在SMARCA4-WT单元格 (图5C和5D)。进一步的分析还发现SMARCA2和TEAD1耗竭之间存在相互依赖关系SMARCA4-突变体，但不是SMARCA4-WT细胞系，尽管程度低于YAP/TAZ (图5C,S7A和S7B)。事实上，我们能够通过H322中的shRNA敲除来证实YAP依赖性SMARCA4-突变细胞 (图S7C和S7D)。
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[size=0.875]图5 [size=0.875]YAP/TEAD以SMARCA2依赖的方式定位在细胞周期基因的增强子上，并且是在SMARCA4-突变细胞
[size=1.125][size=0.875]显示完整标题[size=0.625][size=0.875em]图查看器


, q7 H1 ^# V2 `接下来，我们询问YAP是否与SMARCA2共定位在细胞周期调控基因的增强子上。SMARCA4-突变细胞.对H322细胞的分析表明，YAP和SMARCA2在NEDD9和ARHGAP29(图5E)。如预期的那样，YD23处理消除了这些基因组基因座的SMARCA2峰，这与这些位点的染色质可及性降低一致。有趣的是，由于SMARCA2的丢失，这些增强子处的YAP1峰也丢失了，这表明需要SMARCA2才能有效募集YAP (图5E)。我们还检查了S127和S109处的YAP磷酸化，这两个LATS激酶磷酸化位点已知将YAP隔离到细胞质并阻止其在细胞核中的转录活性。48,49,50我们能够在两个位点显示YAP磷酸化的增加SMARCA4-突变细胞系表明YD23使YAP失活 (图5F)。重要的是，在H322细胞中单独或用YD23处理YAP敲低显着降低了NEDD9 mRNA和蛋白质水平，表明SMARCA2和YAP协同调节NEDD9在其增强子处的表达 (图S7E和S7F)。
& C" d8 |' o$ [7 H4 x& Q鉴于添加YD23选择性地改变YAP活性和在增强子处的结合以调节细胞周期基因的基因表达，我们假设YAP是否可以挽救YD23-mediated对细胞生长的影响。我们产生了在H1693和H322中过表达yap-wt或YAP活性突变体 (YAP-5SA) 的细胞系SMARCA4-突变细胞系 (图S7G)。正如预期的那样，与亲本和yap-wt细胞相比，YAP-5SA降低了YD23诱导的YAP磷酸化 (图S7H)。总的来说，我们注意到，通过过表达yap-wt和YAP-5SA，YD23的生长抑制作用得到了显著但部分的拯救。SMARCA4-突变细胞 (图5G和5h)，最后，我们研究了用TEAD破坏YAP/TAZ是否会敏化SMARCA4-突变细胞对yd23的生长抑制作用。我们使用TEAD的小分子抑制剂VT-107，其是破坏YAP/TAZ与所有四种TEAD (TEAD1-4) 转录因子的相互作用的泛TEAD抑制剂。51我们治疗SMARCA4-突变体和SMARCA4-单独使用YD23或与VT-107联合使用的WT细胞系，并评估对细胞生长的影响 (图S7I和S7J)。值得注意的是，与单独的每种化合物相比，VT-107与YD23组合对生长抑制产生显着影响，而该组合对细胞生长没有任何显着的抑制作用。SMARCA4-WT细胞系 (图S7I和S7J)。在这些结果的基础上，我们进行了VT-107和YD23的基质滴定，并使用SynergyFinder 3.0根据bliss独立性模型评估了对生长抑制的协同反应。52YD23与VT-107对细胞生长抑制表现出协同作用SMARCA4-未观察到的突变细胞系SMARCA4-WT细胞系 (图5I和5J)。此外，在细胞生长与VT-107的类似的协同作用也明显与ACBI2组合SMARCA4-突变细胞，而不是在SMARCA4-WT单元格 (图S7K-S7N)。综上所述，这些发现揭示了YAP和SMARCA2之间通过调节细胞周期在增强子重编程中的机制联系。SMARCA4-突变肺癌细胞.
' c6 S6 p9 a2 d) l( jYD23的抗肿瘤活性SMARCA4-NSCLC的突变模型最后，我们试图使用人类异种移植肿瘤模型研究YD23的治疗潜力。体内。我们首先进行了药代动力学 (PK) 和药物代谢研究，以确定进行体内实验采用yd23。最初的PK分析显示，YD23的单次腹膜内 (i.p.) 剂量为50 mg/kg− 1在小鼠中，血浆中仅实现了适度的药物暴露 (图6A)。对小鼠肝微粒体分析的代谢物分析表明，YD23由于其醚键的O-脱烷基化导致失活而迅速代谢 (图S8A)。细胞色素p450 (cyp) 是主要的酶，在外源性物质的代谢中起重要作用，包括激素，胆汁酸和固醇以及许多药物。53具体地，CYPs，特别是CYP3A4/5，催化羟基化和氧化反应，例如O-脱烷基化，导致其底物失活。重要的是，利托那韦，一种CYP3A4/5抑制剂，通常在患者中施用以提高被CYP3A4/5广泛代谢的药物的生物利用度，例如抗病毒HIV药物或作为COVID-19的Paxlovid的成分。54,55因此，我们推断利托那韦与YD23的共同施用将实现更高的血浆药物暴露水平，从而允许抗肿瘤活性的治疗性评估。实际上，与单独使用YD23相比，利托那韦在小鼠肝微粒体测定中显着延长了YD23的半衰期 (图S8B)。此外，50毫克/千克的共同给药− 1YD23含12.5毫克千克− 1小鼠中的利托那韦导致血浆中YD23的最大浓度提高了5倍 (C最大值) 为5.4 μ m，半衰期约为5小时 (图6A)。

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[size=0.875]图6 [size=0.875]YD23抑制生长SMARCA4-肺癌的突变异种移植模型
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接下来，我们评估了YD23的体内抗肿瘤功效活性。我们首先在a中测试了YD23SMARCA4-无胸腺裸雌性小鼠中的突变H1568异种移植模型，并共同施用12.5 mg kg− 1YD23和12.5毫克千克− 1利托那韦每日一次给药方案可触及的肿瘤，直到实验结束 (图6B)。我们发现YD23在12.5毫克公斤− 1与载体对照相比，每日给药有效地抑制了肿瘤生长。与载体治疗的对照肿瘤相比，YD23能够实现72% 的肿瘤生长抑制 (TGI) (图6B)。本研究对肿瘤蛋白裂解物的分析表明，相对于载体对照治疗的肿瘤，YD23将SMARCA2水平显着降低了88% (图6D和6E)。此外，这些相同肿瘤的免疫组织化学 (IHC) 分析显示，YD23治疗也减少了SMARCA2阳性细胞的数量 (相对于载体治疗的肿瘤，51% SMARCA2阳性) (图6F和6g)。我们评估了YD23在两个额外的SMARCA4-突变肺癌模型，H322和H2126 (图6C和S8C)。在这两种模型中，每日i.p给药12.5 mg/kg− 1YD23有效抑制肿瘤生长，TGI分别为49% 和44%。对来自两种异种移植物的肿瘤蛋白裂解物的分析表明，相对于对照组，YD23将SMARCA2蛋白水平分别降低了76% 和34% (图6D, 6E,S8D和S8E)。同样，这些肿瘤的IHC分析显示，YD23减少了SMARCA2阳性细胞的数量 (相对于载体治疗的肿瘤，H322减少62%; H2126减少46%) (图6F、6g和S8E)。在所有三个抗肿瘤功效实验中，YD23引起体重的适度降低 (与媒介物处理的对照相比5-10%) 以及轻度腹膜炎的注射部位刺激迹象，但在进行的实验的剂量和持续时间下可以耐受 (图S8F;表S4和S5)。值得注意的是，没有SMARCA4-此处评估的突变肺癌模型导致肿瘤完全消退，与使用SMARCA2降解protac的其他抗肿瘤功效研究一致26,27提示协同组合的鉴定对于有效的临床翻译是必需的。基于我们的体外观察结果，我们评估了TEAD/YAP抑制剂VT-107和YD23的组合是否比单独使用单一药物具有更好的疗效。该组合在小鼠中耐受性良好，我们能够在我们的H1568异种移植模型中观察到中等程度的加性组合效应 (图S8G和S8H)。总的来说，YD23可以选择性地降解SMARCA2体内允许在人异种移植模型中有效的抗肿瘤作用。
讨论在这项研究中，我们报告了基于E3连接酶cereblon的有效且选择性的SMARCA2降解PROTAC的发现和表征。几项研究已经明确地表明，合成致命的遗传相互作用SMARCA2和SMARCA4。19,20,22,23,26,27遗传相互作用的强度加上大量的患者SMARCA4突变强烈表明，针对这种合成致死性的治疗可能会像PARP抑制剂一样在BRCA突变肿瘤。
由于无意的SMARCA4降解的预期毒性，高选择性的SMARCA2降解剂 (对SMARCA4具有有限的活性) 对于临床开发是期望的。这是由小鼠敲除研究得出的，该研究表明SMARCA4对于组织维持的重要性以及SMARCA4 ATPase活性的药理学抑制剂对小鼠的明显毒性。24,56,57由于SMARCA2和SMARCA4之间序列同一性的高度相似性，开发SMARCA2的高度选择性抑制剂一直是具有挑战性的。到目前为止，几个双SMARCA2/4降解器，以及定义明确的遗传编码模型系统中的dTAG系统，已经开发出有助于阐明SMARCA2/4 ATPase活性双重丧失的机制基础，例如用于前列腺癌和神经胶质瘤的那些癌症模型。58,59,60然而，尽管最近开发了具有超过smarca4的选择性的SMARCA2降解剂，但对增强子调节的选择性SMARCA2降解的性质和确切原因仍然难以捉摸。26,27,28
5 n: e& E4 e$ l" b3 @" z8 `$ m( W在我们的研究中，YAP/TEAD轴成为与SMARCA2合作以在不存在smarc4的情况下驱动癌细胞生长的关键参与者。值得注意的是，我们观察到SMARCA2降解显着降低了选择细胞周期调控基因增强子上YAP的染色质占有率。这与最近的发现一致，该发现暗示SWI/SNF复合物作为核小体和转录因子之间相互作用的稳定剂，例如用于协同和有效的染色质重塑和转录反应的AP-1。41重要的是，我们对YAP的遗传消除或TEAD的药理学抑制结果概括了最近的报告，该报告表明YAP是SWI/SNF突变癌细胞所表现出的复杂癌细胞表型所必需的。61与先前关于SMARCA2降解剂ACBI2的报道一致，我们没有观察到通过施用yd23的坦率的肿瘤消退。这可能是由于癌细胞的表观遗传重组和利用其他染色质重塑剂来生存，尽管它们的增殖受到抑制，需要进一步研究。62
2 g+ ^1 {4 M+ C5 a6 P5 u: x总之，我们详细的机理研究已经确定了SMARCA2/SMARCA4合成致死率的分子基础，SMARCA2降解剂的作用机理，并确定了TEAD抑制剂与SMARCA2降解剂的协同组合伙伴。我们预计这项研究将刺激未来的临床前研究和临床研究，以瞄准SMARCA4-突变癌症，并扩大SMARCA2降解剂和YAP/TEAD抑制剂的翻译潜力。
研究的局限性我们的报告集中在我们产生的原型PROTAC，YD23，其在接头区域中利用氟苯基部分，赋予对smarca2的高选择性。尽管付出了巨大的努力，但我们仍无法解析SMARCA2-cereblon-YD23三元复合物的共晶结构，这将使我们能够以原子分辨率确定这种选择性的来源。虽然我们使用互补的遗传方法和不相关的SMARCA2 PROTAC ACBI2证实了我们的关键发现，但YD23的一个主要警告是其缓慢的降解动力学，使其不适用于需要非常快速起效的测定。YD23是代谢不稳定的，需要与代谢增强剂一起给药，这可能会产生意想不到的后果。虽然我们在多个细胞系中观察到VT-107和两个SMARCA2降解剂之间的有效协同作用，但效果体内更为温和，表明将来需要使用更稳定和口服生物可利用的SMARCA2降解剂进行勤奋的剂量和时间表优化。
意义癌症基因组学革命为我们提供了详尽的肿瘤抑制基因和驱动癌基因列表，这些基因是治疗发展的主要目标。其中一个发现是SWI/SNF染色质重塑复合物亚基的高频率突变，例如SMARCA4跨越多种实体瘤，包括非小细胞肺癌。然而，SWI/SNF复合物中的突变是失活的，并且不能直接靶向治疗。因此，迫切需要鉴定SWI/SNF突变体中的合成致死或其他脆弱性。我们和其他人已经发现SMARCA2是合成的致命遗传相互作用伙伴SMARCA4。因此，SMARCA2是高价值目标。最近的研究报道了具有不同程度的效力和选择性的SMARCA2降解剂的开发。重要的是，SMARCA2降解剂的作用机制仍不清楚。该手稿报告了增强子重新布线，导致关键细胞周期调控基因的表达受到抑制，这是SMARCA2降解的主要作用机制。此外，机制研究还暗示了Hippo途径的核效应子YAP/TEAD是SMARCA2的关键合谋，以推动SMARCA4-可以被SMARCA2降解破坏的突变癌细胞。重要的是，TEAD抑制和SMARCA2降解的组合协同地消除了SMARCA4突变癌细胞。这些发现可能会刺激这种组合作为治疗方法的未来临床前研究和临床研究。此外，SMARCA2的药理学操作可用于调节用于研究或治疗目的的增强剂的可及性。
资源可用性导线触点有关资源和试剂的更多信息和请求应直接联系主要联系人Yonathan Lissanu (ylissanu@mdanderson.org)。
材料可用性本研究中使用的异双功能降解剂，质粒和细胞系可从导线触点根据要求并完成材料转让协议。
# r& Z* l+ w. I1 X% X数据和代码可用性[size=0.75]•
; @2 \8 P8 D7 j# g/ B5 W2 S5 t2 g2 YChip-seq，rna-seq和atac-seq的处理数据已根据NCBI Geo登录号保存到适当的存储库中:GSE236590。所有其他数据都可以从导线触点根据要求。
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分析本文报告的数据所需的任何其他信息可从导线触点根据要求。
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( W% [# H4 J8 m# h$ C% z+ i( n  X' ]/ d  x' U
6 @  U) E* w4 Z/ k' q# @; N* e& K致谢我们感谢MD安德森癌症中心 (MDACC) 的核心设施，包括先进技术基因组学核心和表观基因组学分析核心。山江协助维持小鼠殖民地。我们也感谢Jack Roth博士和胸外科-研究部门的其他成员在该项目的进展过程中提供的宝贵意见。这项研究得到了德克萨斯大学MD安德森肺癌月球射击计划 (Y.L.) 的慷慨慈善捐款的部分支持。这项工作也得到了NIH资助R01CA272945 (Y.L.) 和R37CA251629 (Y.L.) 以及美国肺脏协会IA-932786 (Y.L.) 的支持。
/ l# R" H1 [/ A4 X7 I+ k+ Y9 O作者投稿S.K.和n.B.设计了研究，解释了数据，并在X.L.的帮助下进行了大部分实验，Y.W.,P.P.,Y.H.,H.M.,A.k.s.和T.N.L.S.K. 执行了体内药理学实验。N.B. 写了手稿并格式化了所有数字。Y.X.进行atac-seq、rna-seq、CUT & RUN和整合分析的计算分析。M.q.执行CUT & RUN并支持CUT & RUN的计算分析。J.w.提供评论并参与计算分析。Y.L. 构思了这项工作，设计了研究，设计了PROTACs，监督了该项目并撰写了手稿。所有作者都对这篇论文发表了评论。
" n1 s( A# ?( `2 V" w利益声明Y.L. 拥有YD23和相关化合物的专利。专利 # wo2023/129506。
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